干货分享—这些常规细胞实验

细胞增殖实验

细胞增殖与细胞凋亡、细胞周期等是肿瘤研究的重要表型，是分子生物学和药理学研究解决的问题之一。通过在细胞中过表达或干扰某个基因研究基因对细胞增殖能力的影响，进一步研究基因的功能，或对细胞进行药物处理，研究药物对增殖的影响。

1. MTT法：是一种检测细胞存活和生长的方法。该方法已广泛用于生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济、快捷。

原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

2. CCK-8法:可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析，常用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。

原理：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

3. Brdu: 即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期，S期活体注射或细胞培养加入。而后利用抗Brdu单克隆抗体ICC染色显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物双重染色可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。

但由于抗体分子量大，难于掺入并被有效检测。因此BrdU检测需采用DNA酶或HCl或加热使DNA变性。这些处理方法会破坏抗原识别位点，此外许多细胞周期分析的染料都需要dsDNA。这种处理方法也使得同一样本无法同时进行细胞周期分析。对于植物细胞等有细胞壁的分析。采用抗体检测还需要消化细胞壁，细胞壁消化酶常含有一些杂质，会导致检测的可靠性降低，同时BrdU检测则需要进行长时间的孵育--几个小时甚至过夜。

4. EDU: 即5-Ethynyl-2’- deoxyuridine, 是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中。通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

细胞凋亡

细胞凋亡是肿瘤和发育研究的重点，同时也是药理学研究的热点。细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自主结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。

细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程。

ANNEXIN V-PI法: 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

细胞膜片钳技术

膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）

原理：膜片钳技术是用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定点位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。

用场效应管运算放大器构成的I-V转换器是测量回路的核心部分。在场效应管运算放大器的正负输入端子为等电位，向正输入端子施加指令电位时，由于短路负端子以及膜片都可等电位地达到钳制的目的，当膜片微电极尖端与默片之间形成10GΩ以上封接时，其间的分流电流达到最小，横跨膜片的电流可100%作为来自膜片电极的记录电流（lp）而被测量出来。

细胞迁移和侵袭

在肿瘤发展过程中，细胞进入循环系统的能力是重要的研究对象。相关的信号通路主要可以分为控制细胞黏附和控制细胞骨架。细胞的迁移与侵袭主要与细胞骨架和黏附相关。肿瘤细胞侵袭和迁移能力的改变通常采用Transwell进行检测。细胞划痕也是测定肿瘤细胞运动特性的方法，由于无法区别正常增殖和迁移细胞，应用有局限性。

1.Transwell实验

Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

肿瘤侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

✓目的：研究目的基因过表达/干扰对细胞侵袭、转移能力的影响

✓材料：正常细胞、对照慢病毒、过表达基因慢病毒

✓步骤：细胞复苏——Transwell铺板——细胞培养及染色——拍照

✓结果：

2. 划痕实验：

划痕实验检测细胞迁移的原理：在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，在显微镜下观察并拍照记录特定位置细胞的生长迁移能力。

实验通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。

细胞周期检测

细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期反应了细胞增殖速度，单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

原理：细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的 G0/G1期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

✓目的：通过慢病毒感染获得基因过表达的细胞株，利用PI染色法结合流式细胞术检测各组细胞周期的变化。从而研究目的基因对细胞周期的影响。

✓材料：目的细胞、病毒

✓步骤：细胞准备——样品收集——上机检测——数据分析

✓结果：

细胞克隆实验

细胞克隆实验原理：单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所形成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3 - 1.0mm之间。

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数， 但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖并形成克隆。只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。克隆形成率反映细胞的独立生存能力的强弱，用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在培养皿中，持续一周以上，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

✓目的：通过目的基因过表达/干扰细胞组、空细胞组与阴性对照组(空病毒)克隆形成数量的统计学分析，研究基因对细胞群体依赖性和增殖能力的影响。

✓材料：病毒和细胞株

✓步骤：铺板——细胞培养——观察克隆，染色，计算克隆形成率

细胞粘附实验

细胞粘附实验实验原理：细胞黏附性是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，并且对细胞的增殖、分化有重要影响。通常可分为两类，即细胞与细胞黏附和细胞与基质黏附。

机体内许多细胞，如上皮细胞，需要牢固地定在某处发挥功能；另一些细胞，如白细胞，活跃运动，就需要不断调节细胞黏附。细胞黏附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力，提示这些细胞在相互识别及黏附机制方面发生了改变。

实验方法：

1、将4.5×105个Hep3B细胞/孔传代于无菌6孔培养板中。

2、培养24h后，用Lipofectamine TM 2000将37LRP siRNA转染Hep3B细胞（两个平行孔，Lipofectamine TM 2000转染具体操作见方法7），转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及不行转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。

3、培养48小时后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液。

4、用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜胶备用。

5、96孔板每孔中铺Matrigel 2ug/50ul，放于超净台中风干过夜。